Research and Application Progress on Recognition Components for Surface Plasmon Resonance Sensors in the Pharmaceutical Field

表面等离子共振（SPR）^{[1, 2]}是指当偏振光以特定角度照射金属或其他导电材料时，在介质（通常是玻璃和液体）与金属之间的界面发生全反射，然后产生消逝波，同时入射光激发金属中的自由电子进行纵向振动，形成等离子波，消逝波与金属膜表面的等离子波发生共振的现象。SPR传感器是一种基于SPR现象发展而来的分析技术，SPR传感器表面结合的生物分子质量的变化使共振波长或共振角度发生偏移，从而能够对生物标记物进行定量监测^[3]。SPR传感器可通过传感器芯片实时、原位和动态测量各种生物分子，如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖，以及病毒、细菌、细胞、小分子化合物之间的相互作用，无须进行标记，也无须纯化各种生物组分，具有灵敏度高和耗样量低等突出优点。

识别元件也被称为目标受体，是生物传感器的重要组成部分。在SPR传感器中，识别元件被固定在传感器芯片上，参与特异性识别和捕获目标分析物，与传感器的选择性能密切相关，是实现生物传感器特异性检测的关键^[4]。目前识别元件主要包括抗体、核酸适配体（Apt）、分子印迹聚合物（MIP）、蛋白质和金属纳米粒子等，分别能够通过对不同的生物样品的特异性结合实现检测。本文简要介绍了SPR传感器中不同识别元件的原理、检测范围、优势以及局限性，重点分析近些年国内外将不同识别元件的SPR传感器应用于医药领域研究的研究成果，如表1所示。

由于抗体对蛋白质、病毒、细菌、细胞以及小分子等具有特异性结合，利用抗体作为识别元件检测生物样品目前在SPR传感器中应用最广泛、最普遍^[41]。随着抗体研发的发展，抗体作为识别元件也更广泛地应用到各种生物样品的检测中，并且其检测限不断降低，检测范围不断增大。

Jena等^[5]基于无标记SPR免疫传感器利用杆状病毒抑制因子5抗体检测狗血清中杆状病毒抑制因子5的含量，方法如图1所示，K_D为12.1 nmol/L，检测限低至6.25 pg/ml，具有高灵敏度和特异性。患乳腺肿瘤犬的血清杆状病毒抑制因子5的平均含量为（110.02±9.77）pg/ml，健康狗血清中检测到的平均含量为（30.28±2.99）pg/ml，这表明SPR传感器在犬科乳腺肿瘤的诊断中具有重要的潜在应用价值。

Widoretno等^[6]为了检测登革热感染，在研究中利用SPR传感器检测非结构蛋白（NS1）抗体和NS1蛋白的相互作用，与目前可用的经典检测方法——酶联免疫吸附测定和逆转录聚合酶链反应进行了比较，在对从印度尼西亚登革热患者收集的26个样本的检测中，SPR能够以更低的浓度和更短的时间正确识别所有16名阳性感染者。酶联免疫吸附测定法对NS1的检测限为8 nmol/L，而SPR传感器检测限低至0.8nmol/L。

Mihoc等^[7]将蛋白水解表位提取质谱法和SPR生物传感器结合，利用肌红蛋白的单克隆抗体检测出马血红素肌红蛋白的K_D为（270±14）nmol/L，脱辅基肌红蛋白的K_D为（350±13.5）nmol/L，并用蛋白水解法通过质谱确定了单克隆抗体和多克隆抗体的抗原表位。Lupu等^{[8, 9]}同样以该法，利用白介素-8的单克隆抗体对白介素进行检测，通过蛋白水解法确定了单克隆抗体的抗原表位。

Ceballos-Alcantarilla等^[10]为了检测吡噻菌胺，开发了其单克隆抗体作为识别元件，优化并验证了基于单克隆抗体的SPR直接免疫测定法，用于快速分析葡萄、葡萄汁和葡萄酒样品中的吡噻菌胺。通过SPR检测的样品结果与液相二级质谱的结果进行比较，发现了极好的相关性（r=0.995），并且在葡萄、葡萄汁和葡萄酒样品中的检测限低至 10 ng/ml。

Acaroz等^[11]采用单克隆抗体作为识别元件，利用SPR检测氟喹诺酮类药物，在优化条件下，该测定表现出非常高的灵敏度，例如，诺氟沙星的检测限可低至0.02 ng/ml。为了证明该方法的适用性，对人工污染的牛奶、肉类、鱼类和虾样品进行了检测，平均回收率分别为88.9%、76.2%、74.4%和77.9%。这些数据表明，该测定方法具有广泛的适用性。

可见，抗体作为一种最常见的特异性很强的识别元件，广泛应用于各种生物分子的检测，包括蛋白质、小分子等，并且具有较高的灵敏度和特异性，能够识别极少量的目标分子，然而抗体也存在制备过程繁琐、易产生交叉反应和易失活等一些缺点。基于抗体作为识别元件的SPR传感器能够进行灵敏精确的生物检测，尤其在感染性疾病的早期诊断和监测中显示出高效性和准确性。

核酸适配体^[13]是基于指数富集的配体系统进化（SELEX）技术从随机寡核苷酸文库中经过8 ~ 20轮不断筛选获得的对靶物质具有很高特异性和亲和力的寡核苷酸序列。这一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，它的出现为生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台，并在许多方面展示了良好的应用前景。基于核酸适配体的SPR生物传感器因其简单、可行、可替代抗体和检测成本低等特点而受到广泛关注。

Zheng等^[14]开发了一种基于双适配体的SPR传感器，用于定量检测β淀粉样蛋白40（Aβ40）聚集体。这种基于双适配体的SPR传感器避免了空间位阻和表位的限制，Aβ40低聚物的检测限低至0.2 pmol/L，并且其操作简单、识别元件的成本较低。该SPR传感器可成功应用于检测人工脑脊液和未稀释的真实脑脊液中的Aβ40聚集体。Sun等^[15]利用适配体具有选择性高、制备简单、保存方便等优点，采用适配体SPR传感器进行糖化血红蛋白（HbA1c）检测，明显提高了HbA1c测量的准确性和灵敏度。

Mihai等^[16]使用基于适配体的SPR传感器对葡萄酒中的过敏原蛋白溶菌酶进行无标记检测，并优化了适配体用量、电泳缓冲液的组成、适配体与蛋白质的孵育时间、流速和样品预处理方式。结果表明，基于适配体的SPR传感器检测葡萄酒中的溶菌酶时具有高准确度和灵敏度，检测限低至2.4 nmol/L，表现出良好稳定性、选择性。并分别在不同化合物（槲皮素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸）存在下检测溶菌酶，其响应值与相同浓度的标准溶液响应值相比明显降低，证明了溶菌酶与槲皮素等酚类化合物具有相互作用。

Torrini等^[17]利用肌钙蛋白T的适配体作为识别元件构建了SPR传感器，通过传感器对肌钙蛋白T进行检测，使用三明治法的适配体SPR传感器表现出更好的选择性，展现了适配体代替抗体作为识别元件的可行性。

Tenaglia等^[18]构建了基于核酸适配体的SPR传感器，直接检测人血清中的妥布霉素，对血药浓度进行监测。结果表明，使用针对妥布霉素的适配体，可以定量检测接受妥布霉素治疗并进行治疗药物监测的患者获得的临床样本中抗生素的浓度，并且基于适配体的直接检测与临床使用的质谱法具有良好的相关性（r=0.99）。

Luan等^[19]利用以核酸适配体为识别元件的SPR传感器筛选和检测氨基糖苷类抗生素，通过监测镀金膜上激光的角度变化，获得实时结合曲线。待测物质中抗生素与其适配体结合的解离常数和化学计量值均可使用SPR传感器的响应进行测量。检测了牛奶中新霉素B，线性范围为10 nmol/L～100 µmol/L，检测限低至5 nmol/L。

Tartaggia等^[21]为了在临床实践中实施抗癌药物伊马替尼的治疗药物监测，依靠适配体作为识别元件，利用SPR传感器进行检测，检测方法具有出色的选择性，并且不受人血浆样品成分的干扰。SPR检测的结果与高效液相色谱-质谱联用技术的结果相比具有良好的相关性（r=0.9999）。其根据监管指南收集了可靠的验证数据，并将该方法与标准分析技术进行了比较，从而为接受伊马替尼治疗的患者的治疗药物监测开发了一种可行的适配体传感器。

Saad等^[22]介绍了一种新的针对军团菌的检测策略——基于表面等离子共振成像（SPRi）的滴定测定法，该测定法使用嗜肺军团菌适配体，能有效避免传统SPR用于全细胞细菌检测存在的不足。与传统检测方法通过细菌培养（7～15 d）和逆转录聚合酶链反应（60～90 min）相比，该检测方法仅需30 min即可给出结果。没有标记或信号放大策略的情况下可以实现10^4.3 CFU/ml检测极限，并且信号放大策略的开发将进一步提高SPRi的滴定测定的灵敏度和准确性，以实现在环境监测或即时诊断等多个领域监测细菌。

Ahn等^[23]将副溶血性弧菌的核酸适配体用于基于SPR的生物传感器，开发了快速、简单、特异的检测方法来检测副溶血性弧菌。由于副溶血性弧菌的某些细胞外成分形成了二级和三级结构，基于适配体的SPR生物传感器平台可以清楚地识别副溶血性弧菌，K_D为2.4 nmol/L。基于核酸适配体的SPR传感器为诊断弧菌感染提供了一个快捷的检测平台，具有巨大的病原体检测潜力。

核酸适配体具有一些天然优势，例如：易于体外大量合成、重复性好、稳定性高且易于贮存；同时，适配体靶标广泛，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素等；适配体易于被标记荧光且活性不受影响，因此易于结合应用其他检测技术。基于核酸适配体为识别元件的SPR传感器，在环境检测中，能够实时和高效的检测污染物、毒素等；在临床诊断中，能够高灵敏度和特异性的检测病原体、癌症标志物或者其他生物分子，并且其操作简便易行、检测成本较低。因此，核酸适配体有望成为优良的识别元件，也有望在SPR领域作为抗体的替代品。

分子印迹技术^{[24, 25]}是在特定的环境（溶剂体系）中，以模板分子（待识别的目标分子）与功能单体发生相互作用形成主客体复合物，在交联剂的作用下功能单体交联聚合并围绕模板分子形成三维网络空间结构，随后模板分子被洗脱，结合位点暴露，三维空间形成印迹孔穴，即MIP。MIP在结合力、官能团、空间形状和大小等方面与目标分子高度互补，对模板分子具有“记忆效应”，可以从复杂的混合物中结合目标分子。因此，MIP具备了生物抗体的两个最重要特性——识别和结合特定目标分子的能力。

Torrini等^[26]以去甲肾上腺素为单体，开发并优化了一种高选择性和高灵敏度的MIP，通过SPR生物传感器利用竞争法检测促性腺激素释放素（图2），实现了实时、无标签的SPR生物检测。通过测试一系列在分子量和主序列方面从高到低相似度的肽验证其选择性，并且在选择性、可重复使用性和成本方面与高效液相和商业酶联免疫吸附测定试剂盒进行了直接比较，结果表明，SPR传感器成本更低，且无需高度培训人员。与抗体相比较，MIP可适应更复杂的环境，显示了以MIP为识别元件的SPR传感器的整体优良特性。

Osman^{[27, 28]}利用分子印迹技术制备了SPR传感器，用于检测人血清中的肌红蛋白。通过在SPR传感器的金表面涂上印有肌红蛋白的聚纳米粒子MIP，制备了基于SPR的MIP传感器，并用不同浓度的肌红蛋白溶液评估了MIP/SPR纳米传感器检测肌红蛋白的能力，结果表明，检测限和定量限分别为4.72 ng/ml和15.74 ng/ml，具有很高的灵敏度。为了确证SPR传感器的选择性，对肌红蛋白、溶菌酶、细胞色素C和牛血清白蛋白的进行了竞争性检测，结果显示，SPR传感器对肌红蛋白有很高的选择性。

Arcadio等^[29]利用一种基于聚甲基丙烯酸甲酯覆盖的金纳米膜，与用于检测牛血清蛋白的MIP受体相结合，利用SPR传感器对牛血清蛋白进行检测，检测限低至8.5 nmol/L，并有进一步提高灵敏度的潜力。开发的SPR芯片可连接简易的光源和光谱仪，为SPR设备的小型化和便携化提供了可能。

Rebelo^[30]利用糖类抗原125（CA-125）制备MIP，以此为识别元件通过SPR传感器检测CA-125。结果表明，该SPR传感器具备良好的选择性和较高的灵敏度，检测限低至0.01 U/ml，线性浓度范围为0.1～500 U/ml。并且可被成功地应用于人工血清样品的CA-125分析，回收率为91%～105%，平均相对误差为5.8%。可见，SPR传感器具有灵敏度高、无需标签、实时检测以及样品消耗低的突出优势。

Deniz等^[31]制备了多巴胺压印的聚纳米颗粒MIP，并以未用多巴胺分子压印的聚纳米颗粒MIP作为对照，利用SPR传感器对水溶液和生物样品中的多巴胺进行了选择性和敏感性检测，在0.01～0.5 ppb浓度范围内获得了良好的线性关系，相关系数r分别为0.990 8（0.01～0.075 ppb）和0.990 9（0.075～0.5 ppb），用0.5 ppb多巴胺溶液评估该SPR传感器的可重复性，测定的相对标准偏差小于1.7%。基于SPR的多巴胺检测技术，有效避免了传统技术样品制备繁琐、成本高、设备复杂等使用限制，并且不需要耦合过程，传感器制备简单，可被成功应用于检测人工血浆和生理血清样品中的多巴胺。

Cennamo等^[32]针对检测SARS-CoV-2病毒的需要，设计了一种特定的MIP受体，并与SPR相结合，用于SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚单位的识别。结果表明，该光学-化学传感器的灵敏度高于逆转录聚合酶链反应，并且检测时间短（10 min），其结果初步证明，MIP/SPR是一种能快速进行SARS-CoV-2病毒检测的方法，可在大量样本上进一步验证。

MIP近些年来在合成上已得到很大的创新和进步，与天然生物分子相比，不但具有同等的识别特异性，还具备了更高的稳定性，并且成本低、制备简单，在取代天然生物分子作为生物传感器识别元件上具有潜在的优势。基于MIP的SPR传感器因其高度选择性和灵敏度，已被广泛应用于包括环境污染物、药物分子等在内的多种小分子检测领域，可以在早期疾病诊断或生物研究中特异性识别生物标志物。

蛋白质作为识别元件可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-小分子的特异性结合，其优点是种类丰富、易于表达、特异性好，并且蛋白质作为药物靶点的主要组成，使基于蛋白质作为识别元件的SPR传感器在筛选药物中可以直接针对关键的生物分子，提高药物疗效和选择性，缺点在于蛋白质的纯化成本较高且费时、稳定性欠佳。

Yang等^[33]为了无标记检测多价蛋白质结合及其动力学过程，利用pNIPAm-co-AAc纳米凝胶与目标分子形成多价蛋白质复合物，将其作为SPR传感器识别元件，可以无标记定量测量多价蛋白结合与单价或非特异性蛋白质-蛋白质相互作用，且不会产生增强响应（图3）。该方法用于检测程序性死亡受体（PD-1）抗体与两种PD-1蛋白多价蛋白结合时，检测限可低至10 nmol/L。该方法能够从复杂的介质中分析双特异性或多价靶分子，而无需或最大限度地减少预处理程序，对多价蛋白结合及其动力学的简便而准确的检测开辟了一条新的途径。

Vachali^[34]使用标准胺偶联方法将叶黄素的类固醇生成急性调节域蛋白3固定在传感器表面，利用SPR传感器来研究类胡萝卜素及其结合蛋白之间的相互作用，该方法简单灵活，有助于快速和可重复地获取结合数据。由于SPR是一种非破坏性方法，有助于最大限度地减少样品使用量。此外，SPR也已经开始用于与类胡萝卜素结合的其他大分子的研究，以表征蛋白的功能。

Zhu等^[35]先用血管紧张素酶2（ACE2）作为识别元件，利用SPR传感器验证了ACE2与刺突蛋白结合结构域的相互作用，测得K_D为0.37 nmol/L。然后分别将ACE2和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2刺突蛋白作为识别元件，通过将含不同浓度（0～125 μmol/L）化合物的20 nmol/L刺突蛋白溶液连续流过ACE2表面，观察信号响应，筛选出阻断作用最强的化合物02B05（去甲泽拉木醛），测定了02B05-ACE2和02B05-刺突蛋白的结合亲和力分别为1.736 μmol/L和1.039 μmol/L，竞争实验结果表明，筛选出的化合物02B05可有效阻断刺突蛋白与ACE2蛋白的结合。

蛋白质作为在SPR传感器中常用的识别元件，在研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子相互作用，靶向药物筛选上具有较大潜力，并且灵敏度高、特异性强，但同抗体一样，仍然存在稳定性欠佳、易失活、保存要求高等特性。利用蛋白质作为识别元件的SPR传感器能够在药物开发过程中帮助筛选和评估候选药物分子与目标蛋白质之间的结合情况。此外，在生物医学研究领域，在探索蛋白质间相互作用、研究蛋白质与其他分子的结合机制等方面的应用，有助于揭示生物分子网络和信号传导路径的复杂性。

由于金属纳米粒子的局域共振与传感薄膜的SPR之间存在共振耦合，因此金属纳米粒子可增强SPR传感器的信号^[36]，在研究中可作为SPR传感器的放大标签。基于金属纳米粒子的SPR传感器可以大大提高其光谱吸收强度，在检测领域具有广阔的应用前景。

Peng等^[37]开发了一种基于银纳米粒子的SPR传感器，用于自动比色检测水样中的痕量Cu²⁺。该方法对Cu²⁺的测定具有高灵敏度和良好的选择性。Cu²⁺浓度为10 μg/L的样品的相对标准偏差（RSD，n=7）为1.21%，25 μg/L的样品的RSD为1.03%。该方法具有简单、快速、低成本和灵敏的特点，已成功应用于水质研究和食品安全，并被证明对现场监测和污染调查具有巨大的潜在价值。

Janani等^[38]报道了一种利用银纳米颗粒作为探针的SPR技术对Hg²⁺进行高灵敏度和特异性检测。在396 nm处的吸光度与20～100 nmol/L Hg²⁺存在着极好的线性关系（r=0.996），具有较高的灵敏度，并且在其他金属离子的检测中表现出了良好特异性，检测水平不受pH、温度和含盐量的影响，在检测和定量测定各种水样中的Hg²⁺离子方面表现出高效性。

金属纳米粒子，特别是金纳米粒子和银纳米粒子，因其独特的光学性质而在增强SPR传感器信号方面扮演了重要角色。这些纳米粒子通过局部表面等离子体共振效应能够显著增强传感器的信号，为检测信号的放大提供了一种独特的方法。尤其在重金属离子检测领域，基于金属纳米粒子的SPR传感器显示出了极高的灵敏度和优良的选择性，这使得它们成为检测痕量污染物的强大工具。然而，尽管金属纳米粒子在增强SPR传感器性能方面具有显著的优势，它们的应用仍然面临一些挑战，其制备和功能化过程需要精确控制，以确保它们具有适当的尺寸、形状和表面化学性质，而这一过程往往复杂且成本较高，限制了基于金属纳米粒子的SPR传感器在更广泛应用中的推广。

抗体是最广泛应用的识别元件，是基于抗原-抗体特异性识别的原理进行检测，但其在检测目标、成本和稳定性方面存在一定限制；核酸适配体合成简便、稳定性高且易于标记，但其更容易受到环境（如：离子强度、盐浓度和pH值）的影响，限制了其在测试中的广泛应用；MIP具有耐热、耐化学试剂和机械性能优良优势，且成本较低，但其制备过程复杂、耗时较长以及模板分子渗漏等问题仍需解决；蛋白质作为识别元件具有靶向筛选药物的潜力，但其存在稳定性差、成本高等局限性；金属纳米粒子作为信号放大标签，在重金属离子检测方面具有独特优势，但应用范围受限、制备要求高（表2）。

本文综述了基于不同识别元件的SPR传感器在临床医药领域中的研究进展，识别元件是SPR传感器的重要组成部分，SPR传感器的发展依赖于识别元件的发展。各种识别元件都在SPR传感器中展现了不同的优势和潜力，相信随着对识别元件的深入研究，SPR传感器不仅可以继续发挥其无需标记、实时快速的优势，而且将在准确度、灵敏度上进一步提高，在医药研究中不断拓展更加广泛的应用领域。