Study on quality standard improvement for Gansu granules

Agilent 1260高效液相色谱仪、DAD紫外检测器、Chemstation色谱工作站（美国Agilent 公司）；XS105DU 电子天平、XS104电子天平（梅特勒公司）；HSW-24 四孔水浴锅、SY-360H超声仪（上海诚献仪器设备有限公司）；DHG-9053A鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DL-I-15台式封闭电炉（天津恒瑞科教仪器有限公司）；ATS 4全自动点样仪（瑞士CAMAG公司）。

乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷为本课题组分离纯化而得，采用高效液相色谱法以峰面积归一化法测定其纯度均大于98％；15批含糖型肝苏颗粒均由四川古蔺肝苏药业有限公司提供，（批号：190401、190402、190403、190404、190405、190406、190407、190408、190409、190410、190411、190412、190111、190119、190123，分别编号为GSKL1～GSKL15，规格：9g/袋）；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为杭州娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

取肝苏颗粒适量，研细（过3号筛），取1.0 g，精密称定，精密加入10 ml 80%甲醇，称定重量，超声提取15 min（功率350 W，频率53 kHz），取出放至室温，用80%甲醇补足失重，摇匀，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷标准品适量，精密称定，置于容量瓶，加入80%甲醇定容至刻度线，制成每1 ml含乔松苷1 mg的标准品溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液5 µl、对照品溶液2 µl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%三氯化铝乙醇溶液，晾干，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光（365 nm）下检视。根据图1显示，供试品色谱与对照品色谱中乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在相同位置显示相同颜色斑点。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～10 min，28%→30% A；10～17.5 min，30%→ 34.5% A；17.5～20 min，34.5%→90% A；检测波长：280 nm（紫外检测时间20 min）；柱温：30 ℃；流速：1.0ml/min；进样量：10 μl。

取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成质量浓度分别为0.24 mg/ml的对照品储备液。

取肝苏颗粒适量，研细（过3号筛），取粉末1.0 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入25 ml 80%甲醇溶液，称定重量，超声处理15 min，取出放至室温，用80%甲醇补足失重，摇匀，取样过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

取提取溶剂80%甲醇与对照品储备液、样品溶液，按上述色谱条件进样10 µl，记录色谱图，结果见图2。根据结果，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷分离效果良好，分离度大于1.5，理论塔板数不低于7700。

量取对照品储备液（240µg/ml）适量，依次用80%甲醇稀释成240、120、60、24、4.8、2.4µg/ml，以进样质量为横坐标 (X) ，峰面积为纵坐标 (Y) 进行回归，得乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的标准曲线为：Y=2323.5748X+2.0537，r= 0.9999，表明乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在2.4~240 µg/ml范围内线性关系良好。

精密吸取对照品溶液（240µg/ml）10µl，在上述液相色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积RSD为0.13%，表明仪器精密度良好。

取肝苏颗粒(GSKL-10)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份，测定峰面积，结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰的平均峰面积为1789.29，RSD为2.12%，表明该方法重复性良好。

取肝苏颗粒（GSKL-10），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样，结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积为1788.29，RSD为0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

分别称取肝苏颗粒（GSKL-10）6份已知含量的样品约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按照接近 1∶1 的量计算所需添加的乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，加入到样品中，按“2.2.3”项下方法平行制成6份供试品溶液，进样 10 μl，记录峰面积，结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率为100.76%，RSD 为 0.66%，说明该方法准确度较好，计算结果见表1。

分别取每批肝苏颗粒适量，研细（过3号筛），取粉末1.0 g，精密称定，按“2.2.3”项下的方法制成供试品溶液，每批样品平行制备2份，每份进样3次，进样量10 μl，记录峰面积，计算乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量，结果见表2。

肝苏颗粒目前没有被中国药典收录，仅收载于《中华人民共和国卫生部部颁标准中药成方制剂十三册》附录中，其中将槲皮素作为薄层鉴别项下的主要成分，但是槲皮素的含量较低，且专属性较差。按照部颁标准的方法制备供试品溶液，方法较为繁琐且样品浓稠不易展开。本研究结合前期关于肝苏颗粒活性成分的报道^[9-12]，选择了乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷为特征成分进行薄层鉴别。在本实验中，综合考察了供试品的点样体积（2 µl、5 µl）对薄层展开的影响，发现样品点样量5 µl、对照品点样量2 µl并点成条带状，视检结果最佳。为了进一步考察薄层鉴别的适用性，本研究还对实验室温度（4 ℃、22 ℃）、湿度（30%、70%）以及不同品牌硅胶板（MachereyNagel牌、黄海牌、银龙牌）进行了考察，发现本实验建立的肝苏颗粒薄层鉴别方法耐用性较好，可以更好的实现肝苏颗粒质量标准提升。

文献研究发现，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖在肝苏颗粒中的含量较高，且具有较高的专属性，因此，在本研究中将其作为肝苏颗粒的含量测定的指标性成分。同时，在确定含量测定成分的基础上，为了充分获得肝苏颗粒中的乔松素-7-O-β-D-葡萄糖的含量，本研究对供试品溶液的提取方法（超声、回流）、提取溶剂（水、不同体积分数的甲醇）、提取料液比（1∶25、1∶50、1∶100）及提取时间（0.25、0.5、0.75 h）等进行了考察，最终确定采用80％甲醇（1∶25）超声提取0.25 h作为肝苏颗粒供试品溶液的制备方法。

本研究采用二极管阵列检测器对待测成分进行了全波长光谱扫描，结果显示，待测成分在280 nm波长处均有较强吸收，基线较平稳，分离度较好，且测定不受杂质的干扰，故最终选择280 nm作为检测波长。本研究考察了2种流动相体系（乙腈-水、甲醇-水）对色谱峰峰形的影响，发现乙腈-水系统能够实现乔松素-7-O-β-D-葡萄糖的分离度，但是出现了较为严重的拖尾现象。通过对乔松素-7-O-β-D-葡萄糖结构的分析发现，其中含有较多的酚羟基，因此在水相中添加酸（0.5%甲酸）会大大改善乔松素-7-O-β-D-葡萄糖拖尾的现象，故选择乙腈-0.5％甲酸溶液作为流动相。当然，在本研究中还对肝苏颗粒中乔松素-7-O-β-D-葡萄糖的含量测定的耐用性进行了考察，通过外标一点法分别对不同仪器不同色谱柱[Atlantis®T3 (4.6 mm×250 mm，5µm)、DikmaDiamonsilC₁₈ (4.6 mm×250 mm，5µm)]、不同柱温（20、25、30 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2ml/min）进行考察，发现均能够满足乔松素-7-O-β-D-葡萄糖的含量测定，说明本研究建立的乔松素-7-O-β-D-葡萄糖含量测定方法具有很强的普适性。

综上，本文建立的肝苏颗粒薄层鉴别及乔松素-7-O-β-D-葡萄糖含量测定的方法，解决了现行标准中供试品制备繁琐、指标性成分含量低且专属性差的难点，具有精密度高、重复性好和稳定有效的特点。综合考虑测定结果及肝苏颗粒制备过程中该成分的转移率，拟定本品每袋含乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于12.0 mg，可用于肝苏颗粒药品质量的控制。