In vivo pharmacokinetics and in vitro-in vivo correlation of silymarin phospholipid complex microporous osmotic pump controlled-release tablets in beagle dogs

DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥机（上海一恒科技有限公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器，美国Agilent公司）；RCZ-6BZ型药物溶出仪（上海黄海药检仪器有限公司）；AL204型分析天平（Mettler Toledo仪器有限公司）；Vortex-5型涡旋混合机（海门市Kylin-Bell有限公司）；QB-212型摇摆式混匀器（海门市Kylin-Bell有限公司）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）。

SM-PC MPOP片（自制，含SM 30mg，批号：131205）；聚氧乙烯（阿拉丁试剂有限公司）；氯化钠、醋酸纤维素、十二烷基硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；水飞蓟素胶囊（Legalon^®，Madaus AG，规格：以SB计相当于SM140 mg）；水飞蓟宾对照品（纯度：98.0%，上海同田生物技术股份有限公司，批号：120115）；甲萘酚（国药集团化学试剂有限公司）；β-葡萄糖醛酸酶（美国sigma公司）；甲基叔丁基醚（色谱纯，上海阿拉丁试剂公司）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

健康成年比格犬，体质量（12±3） kg，购于四川省简阳市简城比尔动物养殖场，合格证号：SCXK（川）2009-15。

称取处方量的SM-PC（其制备工艺另文发表）、氯化钠、聚氧乙烯，等量递加法混合均匀，采用12 mm冲模直接压片（每片含SM 30 mg，硬度为40 N），即得微孔渗透泵的片芯。将醋酸纤维素、聚氧乙烯溶于丙酮-异丙醇（90∶10）中，即得包衣溶液。将片芯置于包衣锅内，温度为45 ℃，恒流泵流速3.0 r/min，压力0.5 MPa条件下进行包衣操作，直至衣膜达到预定要求为止。所得制剂在在40 ℃条件下干燥12 h，即得SM-PC MPOP片。

采用《中华人民共和国药典》溶出度测定法规定的桨法进行测定^[11]，以pH7.5的磷酸盐缓冲液900 ml为释放介质（添加0.5%十二烷基硫酸钠），温度（37±0.5） ℃，转速为100 r/min。于1、2、4、6、8、10和12 h各取出样品10 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过，及时补充等温度等体积的溶出介质10 ml。取续滤液进HPLC分析。另取SB对照品适量，精密称定，置于量瓶中，适量甲醇溶解并稀释至刻度，同法测定，计算不同时间内SM的主要成分SB的累积释放度，绘制释放曲线。

色谱柱为 Kromasil C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长为288 nm，流速为1 ml/min，柱温40 ℃，进样量为20 μl，流动相为甲醇-0.05%磷酸的梯度洗脱（0～4 min，35% A；4～16 min，35% A→40% A; 16～23 min，40% A→45% A; 23～40 min，45% A→50% A）。

SB系列对照品溶液的制备：取SB对照品约10 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加入适量的甲醇溶剂，轻微振摇使溶解，再添加一定量的甲醇稀释至刻度，配制得到浓度为464.0 μg/ml的SB对照品母液。用移液管精密移取该对照品母液0.25、0.5 ml于100 ml量瓶中；0.25、0.5、1、2和5 ml分别置于10 ml量瓶中，加65%甲醇溶液稀释至刻度，配成浓度依次为1.160、2.320、11.60、23.20、46.40、92.80和232.0 μg/ml的系列标准液，贮存备用。

甲萘酚内标溶液的制备：取甲萘酚约100 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加一定量甲醇溶液，轻微振摇使溶解，再加适量的甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取摇匀后的溶液5 ml于100 ml量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，制备得到浓度为54.80 μg/ml的内标液，贮存备用。

使用一次性采血针采集比格犬前肢的血液3.0 ml，置于真空采血管（添加肝素钠）中，用离心机在4 000 r/min的条件下离心10 min，取上层淡黄色液体，得到血浆样品。用移液枪精密吸取血浆（空白血浆或含药血浆）1.0 ml于10 ml具塞塑料离心管中，加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）0.5 ml，用涡旋混合机混合均匀，再添加β-葡萄糖醛酸酶（酶活性相当于50 U）50 μl，涡旋混合30 s，37 ℃水浴中孵育约16 h，孵育结束后，添加内标液50 μl，混匀后加入pH 8.5的硼酸盐缓冲液2.0 ml，继续涡旋混合30 s，再添加甲基叔丁基醚4.0 ml，涡旋混合2 min使溶液均匀，最后置于3 000 r/min的离心机中离心10 min，分离得到上清液。将上清液置于40 ℃水浴下用氮气挥干，残渣用65%甲醇溶液100 μl复溶，涡旋混合1 min，精密吸取上清液20 μl进样。

按照“2.3.1”项下色谱条件和“2.3.3”项下血浆样品处理方法处理和检测空白血浆、加药血浆和服药后血浆样品，记录色谱图，考察血浆内源性物质对内标、SB及其异构体的检测是否有干扰，结果见图1。

由图1可见，SB、甲萘酚与血浆中的内源性物质分离良好，SB两个峰的保留时间分别为30.8 min和32.3 min，内标的保留时间为37.1 min。

精密吸取空白血浆1.0 ml，置于10 ml带塞圆底离心管，按“2.3.2”项下加入SB系列标准液50 μl，配制成浓度为0.060、0.120、0.580、1.160、2.320、4.640和11.60 μg/ml的血浆样品，按“2.3.3”项下方法处理，以SB的峰面积与内标甲萘酚峰面积的比值A_s/A_is对SB的浓度C（μg/ml）进行线性回归，用加权最小二乘法（权重为1/C）进行计算，得标准曲线方程：Y=0.680 7X+0.093 9（r=0.998 0），可见，在0.06~11.6 μg/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系。

取空白血浆加入逐级稀释的SB标准溶液，按照信噪比为10的标准确定血浆样品中SB的最低定量限为0.05 μg/ml。

取低、中、高3个浓度（0.060、1.160、4.640 μg/ml）的血浆样品，按“2.3.3”项下方法处理，根据线性方程计算样品的浓度。于1天内连续测定5次，连续5天重复测定，计算日内、日间精密度和准确度，结果见表1。结果日内、日间精密度以及准确度均符合相关规定。

取SB血浆样品（浓度为1.16 μg/ml），分别进行以下研究：（1）冻融考察：样品放置在冰箱中，冰冻温度为−80 ℃，解冻温度为25 ℃，反复冻融3次，进行稳定性考察。（2）长期冷冻考察：将SB血浆样品于−80 ℃的冰箱中放置１个月后进行稳定性考察。（3）血浆样品处理后24 h的稳定性考察：将血浆样品按“2.3.3”项下方法进行前处理，室温下保存24 h，按“2.3.1”项下条件进行测定，把测定的峰面积代入当天的标准曲线，计算回收率。结果表明，在3种稳定性考察中，SB的回收率>90.8%，RSD<9.5%（n=3），表明血浆样品反复3次冻融后稳定性良好；血浆样品在−80 ℃的冰箱中至少可以保存１个月；血浆样品处理后可在室温下保存24 h。因此，SB在比格犬血浆中的稳定性符合生物样品的检测要求。

取SB低、中、高3个浓度（0.06、1.16、4.64 μg/ml）的血浆样品，按“2.3.3”项下方法处理，进样测定SB与内标峰面积的比值A₁，另取配制好的相应浓度的SB和内标溶液，取20 μl进样，得SB与内标峰面积比值 A₂，按照公式：提取回收率（%）=（A₁/A₂）×100 %计算SB在低、中、高三个浓度的提取回收率为（68.59±8.37）%、（73.58±5.62）%、（70.26±4.15）%，同法测得内标甲萘酚的提取回收率为（81.8±3.51）%。

参考文献[12]并结合预实验，确定试验动物的给药剂量为水飞蓟素30 mg/kg。

采用双周期两制剂的双交叉实验设计，即将6只健康比格犬按体质量随机分成两组，交叉给予受试制剂（SM-PC MPOP）和参比制剂（市售水飞蓟素胶囊），洗脱期为 1 周。比格犬喂药前应先禁食12 h，空腹抽取空白血5 ml，按照“2.4.1”项下确定的剂量分别给予比格犬SM-PC MPOP及市售水飞蓟素胶囊，给药4 h以后进食低脂肪食物，在比格犬前肢小静脉处安置留置针，受试制剂组分别于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h采血3 ml，参比试剂组分别于第0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 各采血3 ml。 因受试制剂为缓释制剂，故在前1 h内采样点相较参比制剂（普通胶囊）密集。完成采样后间隔1周，1周后交叉给药，同时间点采血。血样置于用肝素抗凝的真空采血管中，立即于3 500 r/min的条件下离心取血浆，于−20 ℃保存，待测。

受试制剂和参比试剂的血药浓度-时间曲线见图2。

将受试制剂和参比制剂对应采血时间的血药浓度数据进行处理，计算非房室模型药动学参数，结果见表2。

以非房室模型的数据计算SM-PC MPOP对市售水飞蓟素胶囊的相对生物利用度，可用下面的公式来计算：

虽受试制剂和参比制剂在剂量方面有所不同，但受试制剂具备线性药动学特征，故对计算结果进行剂量校正，计算得到F_r=（162.21±30.82）%。

反卷积分法（convolution）是FDA推荐的缓控释制剂评价体内外相关性的经典方法，其不需要进行房室模型拟合，直接用数学方法以真实的实验数据计算体内吸收分数。方程的实用形式如下：

由该方程可以解出：

以市售水飞蓟素胶囊为参比，根据体内药动学试验结果计算出市售水飞蓟素胶囊的药-时曲线下面积及自制SM-PC MPOP各时间点的药物浓度，代入方程求出输入函数R（θ）。以R（θ）对相应时间点的累积释放百分率进行线性回归，直线的相关系数大于临界值表示体外释放与体内吸收相关性良好，结果见表3。

以累积释放百分率Y与输入函数R建立的回归方程为Y=−210.008 3R+71.301 7（r=0.839 0），当自由度d_f=n−2=4时，临界值r_4,0.05=0.811，回归方程的相关系数r>r_4,0.05，表明SM-PC MPOP的体外释放与体内吸收具有较好的相关性，即体外释放介质采用pH7.5的磷酸盐缓冲液（含0.5 %十二烷基硫酸钠）是可行的。

由于SM各组分中只有SB含量较高，其余成分含量均较低，采用HPLC法仅能测得主要成分SB的血药浓度。液质联用技术在近年来发展迅猛，不仅分离性能好，而且灵敏度高^[13]。后续可借助超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术（UPLC-MS/MS）同时检测SM的5种成分在比格犬血浆中的含量，更能科学地反映SM-PC MPOP各成分的体内吸收情况。

难溶性药物在血浆样品中多采用乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等进行萃取。试验中对这3种溶剂进行了考察，发现采用乙酸乙酯萃取时回收率较低，乙醚和甲基叔丁基醚无显著差异，但后者沸点比乙醚高，且在实际提取操作过程中溶剂挥发较少，安全性相对较高，因此选择甲基叔丁基醚作为萃取溶剂。

SB口服吸收以后，大部分在肝微粒体中经葡萄糖醛酸化结合形成苷，游离型含量较低，故加入β-葡萄糖醛酸酶水解苷键后测定血药浓度^[14-15]。孵化前加入pH5.0的磷酸缓冲盐溶液调整血浆样品的 pH 以保证β-葡萄糖醛酸酶的活性，水解后再加入pH8.5硼酸盐缓冲液，使SB更多的以分子的形式存在，增加其脂溶性，再使用有机溶剂甲基叔丁基醚提取药物。其中，β-葡萄糖醛酸酶的加入量对测定结果准确性的影响至关重要，加入过少则难以水解完全，而加入过多会使具有紫外吸收的内源性物质被提取出来，增加干扰。

市售水飞蓟素胶囊（Legalon^®）是一种高品质的水飞蓟素制剂，其采用特殊的工艺提取后，水飞蓟素纯度提高，水溶性增加^[16]，具有高含量、高纯度和高体外溶出度等特点。而自制的SM-PC MPOP则是基于卵磷脂复合技术，使得药物脂溶性增加，适宜的脂水分配系数使得药物更容易被胃肠道黏膜吸收，从而提高了生物利用度，两者在制剂技术方面的区别造成生物利用度有所差异。在本研究中，药动学研究结果显示自制的SM-PC MPOP峰浓度降低，实现了SM的成分缓慢释放的目标，且生物利用度高于市售水飞蓟素胶囊。