Study on polymorphism of peritoneal microbial community after laparoscopic exploration in New Zealand rabbits based on 16S rDNA sequencing

雄性2月龄新西兰兔6只（上海甲干生物科技有限公司），体重约为2 kg，分别设置模型组（n = 3）和对照组（n = 3）。

ABI GeneAmp® 9700 型PCR仪；NanoDrop2000型分光光度计；CQZ2000720型便携一体式电子腹腔镜，腹腔镜镜头型号为J1000B型、J1030B型（上海卓外医疗电子科技有限公司）；手提式高压蒸汽灭菌器DSX-24L-I（上海申安医疗器械厂）。

2%戊巴比妥钠溶液（0.4 g戊巴比妥钠粉末溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液）；碘伏溶液；液氮；0.9%氯化钠注射液；手术器械（打孔器、手术刀、组织剪、血管钳、镊子、布巾钳、圆针三角针、手术单）。

随机将6只新西兰兔分成两组，分别设置模型组（n = 3）和对照组（n = 3），模型组麻醉后给予腹腔镜探查术，术后关闭腹腔；对照组麻醉后开腹，然后关闭腹腔。

对模型组新西兰兔称重，耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠（剂量1 ml/kg），麻醉成功后（呼吸平稳，角膜反射消失，身体肌肉松软），脱毛备皮，固定，生理盐水清洗皮肤，碘伏溶液消毒皮肤3次（范围为伤口周围15 cm）。铺手术巾，铺巾钳固定。沿腹正中线上切开皮肤，向下分离肌肉筋膜，切开腹膜，腹腔镜打孔器深入腹腔，插入腹腔镜套筒。将腹腔镜沿腹膜伸进去，到达肝脏表面，探查肝脏及胆囊约2 min。取出腹腔镜及套筒，消毒手术区域，关闭腹腔，缝合手术切口，敷料固定。对对照组进行相同操作，但不进行腹腔镜探查术。待新西兰兔麻醉苏醒后，送回动物饲养中心饲养。

腹腔镜术后模型制备一周后，动物取材。新西兰兔称重，备皮，分别对模型组动物和对照组动物固定、消毒、铺巾，沿腹正中线行5 cm切口，打开腹膜腔，用无菌注射器深入到腹腔后部最低处，吸取约1.5 ml腹腔液体，放入相应编号的EP管中（并备份），液氮冷藏，随后进行16S rDNA测序。

根据 E.Z.N.A.® soil DNA kit （美国Omega Bio-tek公司）进行腹腔液体微生物群落的DNA抽提，使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对 16S rDNA基因V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。在Miseq PE300/NovaSeq PE250平台（美国Illumina公司）进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。使用Fastp软件对原始测序序列进行质控，使用Flash软件进行拼接后，在美吉生物的I-Sanger平台上进行生物信息学分析。

以最小二乘法对样本做判别分析（PLS-DA），寻找物种丰度矩阵和样品分布/分组信息的最大协方差，在门水平和种水平上，模型组样本与对照组样本组内聚合良好、组间区分明显（图1A、图1B）。结果显示为两组样本细菌的种类均一度良好。对两组样本数据做Venn图分析，显示两者共有的OTU数目为957，模型组OTU数目为2206，对照组OTU数目为592。模型组腹水OTU含量高于对照组，表明模型组细菌种类较对照组明显升高（图1C）。

对样本数据进行α多样性分析，菌落丰富度Sobs及Ace值越高提示微生物群落丰度越高，结果显示模型组比对照组微生物群落丰度更高（图2A、图2B）。在微生物群落多样性分析中，Shannon指数提示，数值越高多样性越大；Simpson指数提示，数据越小多样性越大。得出模型组在微生物群落丰度和多样性方面均高于对照组（图2C、图2D）。从Alpha多样性指数表中可得出同样的结论（表1）。

通过对样本的OTU分类学分析，对样本测序结果中的菌种、菌属等进行聚类，通过对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，在丰度-均匀度曲线中，水平方向是物种丰度，曲线在横轴上的宽度越大，提示丰度越高。曲线的形状反映了物种的均匀度，曲线越平缓，物种越丰富。模型组相对于对照组曲线宽度更宽，更平缓。提示模型组细菌种类数量以及含量高于对照组（图2E）。

对样本数据进行微生物组成成分分析，在对照组中其他菌群数量占整体菌群数量的35.08%（图3A），而模型组其他菌群数量占整体菌群数量的65.04%（图3B），说明经过腹腔镜手术后，不明原因的其他菌群数量升高。模型组较对照组菌群占比升高的菌群有出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌等。由此得出结论：腹腔镜手术后杂菌的数量显著增加，且以出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、 正皮氏罗尔斯顿菌等升高为主。

微生物组在目、科、属、种水平上进行物种差异性分析。在目水平上，得出以下微生物群落升高：巴斯德菌目、马赛菌目、沙壤土杆菌目、莫拉菌目、奈瑟菌目、山羊海藻百伯史坦菌目、冢村氏菌目； 在科水平上，发现以下微生物群落升高：巴斯德菌科、奈瑟菌科、紫杉霉菌科、热苜蓿菌科、冢村氏菌科、膜杆菌科、虎蛆科、Akk菌科 、韦荣氏球菌科；在属水平上，发现以下微生物群落升高：巴斯德菌属、马赛菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属、山羊海藻百伯史坦菌属、冢村氏菌属；在种水平上，发现以下微生物群落升高： 巴斯德菌、类芽孢杆菌、奈瑟菌、拉姆利杆菌、马赛菌、赤藓科菌、冢村氏菌、马赛菌、链球菌属。通过分析，发现在目、科、属、种上模型组均有增长且增长较为明显的菌种为巴斯德菌（图4A～图4D)。

随着腹腔镜手术大量应用于临床，相比于传统手术而言，术后感染虽有所下降^[3]，但由于植入材料的应用，腹腔术后感染发生率依然很高。有研究表明，在腹腔镜术后患者的术后感染中革兰阴性菌占半数以上，以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜血菌属为主；革兰阳性菌以溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌为主；真菌以念球菌属、光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌为主^[3-5]。在这些术后感染的病人中，感染的部位主要集中在肺部、腹部和尿道^[5]，从而引起相应术后并发症。

本研究通过对新西兰兔进行腹腔镜探查手术，发现模型组与对照组在样本菌群的聚合度良好，并且在模型组中，菌群的多样性和丰度比对照组高。在进行两组样本微生物群落对比分析中发现，在属水平上模型组的其他菌群占比由35%上升至65%。表明菌群群落数量在腹腔镜手术术后显著升高，且以草酸杆菌科、有益杆菌、巴斯德菌、瘤胃球菌、黄杆菌升高为主，其中巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌导致人感染疾病。研究发现，巴斯德菌是一种来源于动物的革兰阴性球菌，可引起蜂窝织炎、腹膜炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎和化脓性关节炎等疾病^[6]，严重者病死率可达到31%^[7]。瘤胃球菌是一种革兰阳性厌氧菌，是人类正常肠道菌群的一员^[8]，可以导致炎症性肠病^[9]。正皮氏罗尔斯顿菌是革兰阴性杆菌，容易侵袭免疫功能低下的患者，可导致严重的菌血症和肾盂肾炎^[10]。有研究表明，在195名呼吸功能衰竭患者中有黄杆菌定植，但均未出现相应的并发症。微生物菌群物种差异性分析发现，在科、目、种、属水平上，模型组较对照组在巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌、热苜蓿菌、叶绿体、噬纤维菌等均有不同程度上升，而其中巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌可导致人类发病。据相关研究显示。冢村氏菌是一种革兰阳性、专性需氧、弱抗酸细菌，可导致人体肺部感染^[11]。奈瑟菌可导致人体感染尿道炎、脑膜炎^[12]。

　　本研究发现巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌、奈瑟菌、冢村氏菌在模型组呈现显著上升趋势，这些菌种可引起腹腔、尿道、肺部感染，出现严重的腹膜炎、肠梗阻，尿道炎以及脑膜炎，甚至导致病人死亡，对腹腔镜腹腔感染控制有一定的指导意义。由于本次为动物实验，可能存在手术室条件有限，手术者操作不规范等将细菌带入腹腔情况，能否在临床病人身上得出同样的结论，还需要做进一步的研究。