Study on pharmacodynamics and safety of self-made compound ketoconazole ointment

生物安全柜（HFsafe1200型，上海力申科学仪器有限公司）；隔水式恒温培养箱（303-6B型，南通科学仪器厂）；霉菌培养箱（MJ-160型，上海跃进医疗器械厂）；LDZX-40KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

自制复方酮康唑软膏（第九〇〇医院药学科制备，含酮康唑，莫匹罗星，糠酸莫米松，批号20171220）；复方酮康唑乳膏（含酮康唑，丙酸氯倍他索，硫酸新霉素，批号1408028，上海宝龙药业有限公司）；莫匹罗星软膏（含莫匹罗星，批号20161006，人福医药有限公司）；酮康唑乳膏（含酮康唑，批号150302，福建太平洋制药有限公司）。

红色毛癣菌CMCC(F)T1a、须癣毛癣菌CMCC(F)T5a、断发毛癣菌CMCC(F)T4b、犬小孢子菌CMCC(F)M3d、石膏样小孢子菌CMCC(F)M2c、裴氏着色真菌CMCC(F)M2c，均购自中国医学科学院皮肤病研究所。

参考前期研究制备软膏^[4]，酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量依次为2%、2%和0.1%。同时，制备缺酮康唑的阴性对照软膏、缺莫匹罗星的阴性对照软膏分别用于抗真菌试验、抗细菌试验。

取直径9 cm的培养皿，加入20 ml培养液，制成培养基平板。细菌用营养琼脂培养基，37 ℃培养1~3 d；真菌用沙堡弱培养基，28 ℃培养5~7 d。菌落形成后，挑取一定量的菌落，加入1 ml灭菌蒸馏水，充分混合均匀。采用紫外分光光度计调整菌悬液浊度为0.5，相当于5×10 CFU/ml。用无菌棉签蘸取菌悬液，均匀涂布于实验用培养基平皿表面。

采用定性滤纸制成直径7 mm的圆形纸片、经灭菌，尔后分别浸入空白软膏（不含药）、自制复方酮康唑软膏、以及市售的复方酮康唑乳膏、酮康唑乳膏和莫匹罗星软膏的甲醇溶液中，待药液完全浸润纸片后，取出纸片放置于已涂布菌悬液的培养基表面。细菌置隔水式恒温培养箱37 ℃培养3 d，真菌置霉菌培养箱28 ℃培养7 d。观察各药敏纸片周围抑菌圈，并测定其直径值（长径与短径的平均值, mm），每株菌同时做3个平板。

实验计量数据用平均值±标准差（${{\overline x}}\pm s$）表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析（两两间比较用LSD法），以P<0.05表示有统计学差异^[7-9]。

实验结果表明，莫匹罗星软膏和空白软膏的纸片均被真菌包围，而其余3种制剂的纸片均产生了明显的抑菌圈。自制软膏、市售的酮康唑乳膏和复方酮康唑乳膏的抑菌圈直径相当（P>0.05），对不同真菌的抑菌圈直径大小为：断发毛癣菌>石膏样小孢子菌>裴氏着色真菌>须癣毛癣菌>犬小孢子菌>红色毛癣菌。由此可知，各制剂的抑菌圈直径大小顺序为：自制复方酮康唑软膏=复方酮康唑乳膏=酮康唑乳膏>莫匹罗星软膏=阴性对照软膏。提示自制复方酮康唑软膏对真菌的抑菌活性与市售单成分酮康唑乳膏、复方成分的复方酮康唑乳膏相当，结果见表1。

在2种细菌的培养皿中，各组对铜绿假单胞菌均未产生抑菌圈；对金黄色葡萄球菌，空白软膏和市售的酮康唑乳膏未产生抑菌圈，其余制剂产生了明显的抑菌圈。自制软膏与市售莫匹罗星软膏的抑菌圈直径均为20 mm左右（P>0.05），且均显著大于复方酮康唑乳膏（P<0.01）。由此可知，各制剂的抑菌圈直径大小顺序为：自制酮康唑软膏=莫匹罗星软膏>复方酮康唑乳膏>酮康唑乳膏=阴性对照组软膏，结果见表2。

取雌雄各半的健康家兔4只，于试验前24 h，在家兔背部脊柱两侧对称划定左、右各3 cm×3 cm的相同区域。用电剪刀剔除兔毛后，用硫化钠溶液进行脱毛处理，并于脱毛24 h后，检查去毛处皮肤是否损伤，排除损伤皮肤。采用同体左右侧自身对比法，设给药组（自制复方酮康唑软膏）与对照组（空白软膏）。家兔背部左侧皮肤涂布空白软膏，右侧皮肤涂布0.5 g复方酮康唑软膏，然后用一层玻璃纸和二层纱布覆盖，再用胶布和绷带加以固定。

采用封闭实验，贴敷时间为4 h。实验结束后除去受试药品并用温水清洁给药部位，在自然光线下观察皮肤反应。于清洗后的1、24、48、72 h观察涂抹部位皮肤反应，按表3进行皮肤刺激反应评分，并计算受试动物积分的平均值，按表4判断皮肤刺激强度。

观察发现，实验组仅有1只家兔出现勉强可见的轻微红斑，其余均未出现红斑、充血、水肿等刺激症状。根据表3评分，对照组皮肤刺激反应平均积分值为0，而实验组的分值小于0.5（表5），根据表4可认为复方酮康唑软膏单次给药对皮肤无刺激性。

多次刺激性试验中家兔的处理方法和初次给药方法与“2.3.1”项下相同，不同的是，对照组和给药组每天涂抹1次，给药时间持续涂抹14 d。从第2天开始，每次涂抹前修剪毛，用温水清除残留受试物1 h后观察，按表3评分。最后按公式每天每只动物平均积分=红斑和水肿积分总和/（受试动物×14），计算平均积分，以表4判断皮肤刺激强度分级。

多次给药后定期观察发现，对照组的家兔在各时间均未出现红斑、充血和水肿等皮肤刺激。实验组有2只家兔在8、12、13和14 d时出现极轻微的红斑，平均分值为0.25，在其余时间所有家兔无红斑、充血等刺激症状（表6），根据表4可认为复方酮康唑软膏多次给药对皮肤无刺激性。

采用豚鼠为试验动物，试验前约24 h，将豚鼠背部左侧2 cm×2 cm区域的毛剔短后，用硫化钠溶液进行脱毛处理。脱毛后24 h，检查去毛处皮肤是否损伤，有损伤的皮肤不宜进行试验。

试验分为2个阶段，首先在诱导接触阶段，将约0.5 g样品涂于豚鼠皮肤上，用一层玻璃纸和二层纱布覆盖，再以胶布封闭固定6 h；第7天和14天同法重复一次。在激发接触阶段，于末次诱导接触后14~28 d，将约0.2 g的样品涂于豚鼠背部右侧2 cm×2 cm去毛区（接触前24 h脱毛），然后用一层玻璃纸和二层纱布覆盖，再以无刺激胶布固定6 h。激发接触后24 h和48 h观察皮肤反应，按表3评分，当受试组动物出现皮肤反应积分≥2时，认为该动物出现皮肤变态反应(阳性)，按表7判定受试物的致敏强度。

将豚鼠随机分为3组，实验组和阳性对照组均含20只豚鼠，阴性对照组含10只豚鼠。实验组采用上述的复方酮康唑软膏，阳性对照组和阴性对照组的处理方法与实验组基本相同，但阳性对照组采用2,4-二硝基氯代苯为样品，而阴性对照组在诱导接触时不给予任何样品，在激发接触时给予自制复方酮康唑软膏。实验结果如表8所示，自制复方酮康唑软膏致敏率为0，无皮肤变态反应。

在单次、多次刺激性试验和皮肤变态反应试验之后，将试验动物处死，并取左右侧皮肤，经4%多聚甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片后，进行HE染色，最后在倒置相差显微镜下观察皮肤。如图1、2、3所示，在单次、多次刺激性试验和皮肤变态反应试验中，给予自制软膏后，皮肤的各层结构完整，与对照组的正常皮肤组织基本一致。

浅部真菌病主要由毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属引起^[13-14]，其中红色毛癣菌和须癣毛癣菌是手、足癣中最常见的真菌，70%以上的病例中均可检出^[15]，本研究中抗真菌实验选择的菌种均为皮肤癣菌病的最常见的致病菌。酮康唑是抑制真菌的常用药物，本实验显示，自制软膏抗真菌活性与市售制剂相当，特别是在断发毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌方面表现出较强的杀菌活性。

在抗细菌方面，常见浅表局限性皮肤及软组织感染，其引起的病原菌相对简单和明确，主要是金葡菌和化脓性链球菌^[16]。限于实验室条件，本实验仅选取现有的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌两种细菌为试验菌种。实验显示，铜绿假单胞菌不在莫匹罗星抗菌谱中；而含有莫匹罗星的自制软膏在抗金黄色葡萄球菌活性上大大优于市售酮康唑类产品，说明莫匹罗星是本处方较为理想的选择。

浅部真菌感染经治疗后极易复发的重要原因之一是合并细菌感染。有报道称将市售的复方酮康唑乳膏与莫匹罗星软膏交替使用，可对真菌性皮肤溃疡患者有更好的治疗作用^[17]。本研究表明自制复方酮康唑软膏兼具显著的抗真菌和细菌作用，优于多数市售制剂，且单次给药和多次给药的刺激性试验和皮肤变态反应试验表明，自制软膏具有良好的安全性。

自制复方酮康唑软膏的药物组成为浅部真菌感染提供了一种更加简便、有效的治疗手段。综合药效结果和安全性结果，自制软膏有望成为在皮肤浅部真菌感染疾病中，替代市售制剂成为更加优越的选择。