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海马为海龙科动物线纹海马（Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder）、刺海马（H. histrix Kaup）、大海马（H. kuda Bleeker）、三斑海马（H. trimaculatus Leach）或小海马（海蛆）（H. japonicus Kaup）的干燥体。性温，味甘、咸，归肝、肾经，具有温肾壮阳，散结消肿的功效[1]。现代研究表明，海马含有氨基酸、甾体、脂肪酸、微量元素和磷脂等化学成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、性激素样作用和增强机体免疫力等多种药理活性[2]。目前，我国中药材市场上的海马品种众多，且不同品种的海马化学成分和药理作用存在差异，因此深入研究不同品种海马的外观及内在差异，使海马资源得到合理利用显得十分重要。何旭辉等[3]发现不同品种海马在鳃盖的嵴纹和头冠处有较明显的区别，使用微性状鉴别法能够简单快捷的区分出不同品种的海马。陈璐[4]通过海马的本草考证、鉴别及药用品种、化学成分检查项等研究，建立了稳定可控的海马质量评价方法，为《中国药典》中海马内容的补充提供了参考依据。闫珍珍等[5]从营养价值和功能性成分方面分析，三斑海马具有高蛋白、低脂肪的特征，且雌海马氨基酸营养价值优于雄性；除尿苷含量低于雄性外，雌海马的胆甾醇和次黄嘌呤含量均高于雄性，该研究发现为特异性开发海马产品提供了科学依据。陈梦等[6]使用DNA条形码分子鉴定技术表明COI、16 S rRNA、ATP6序列作为条形码均可以鉴定三斑海马及其他混伪品海马药材，为保障海马临床用药安全提供了新的技术手段。三斑海马作为我国较为常见的一种海马，资源丰富，在浙江、广东、海南等沿海地区均有分布[7]。为进一步明确三斑海马的化学成分，更合理地开发利用海马资源，本文以三斑海马为研究对象，对其化学成分进行研究，从三斑海马乙醇提取物中分离鉴定了8个化合物（图1），分别为：L-苯丙氨酸（化合物1，图1A）、丙氨酸（化合物2，图1B）、肌苷（化合物3，图1C）、胆固醇（化合物4，图1D）、N-乙酰基酪胺（化合物5，图1E）、尿嘧啶（化合物6，图1F）、D-甘露醇（化合物7，图1G）、河豚素（化合物8，图1H）。其中，N -乙酰基酪胺 、D-甘露醇、河豚素为首次从三斑海马中分离得到。
图 1 三斑海马分离出的 8 种化合物结构
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实验用海马药材购自安徽亳州药材市场，经海军军医大学辛海量教授鉴定为海龙科动物三斑海马（Hippocampus trimaculatus Leach）的干燥体。
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Bruker DRX-600 MHz 核磁共振仪（TMS内标，德国Bruker公司）；1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；柱层析硅胶、GF254薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（GE Pharmacia公司）；ACE 3 C18-PFP色谱柱（3.0 mm×150 mm, 3.0 μm, 美国Agilent公司）；其余试剂为分析纯。
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干燥三斑海马药材1.74 kg，剪碎后10倍量95%乙醇浸泡过夜，85 ℃加热回流提取3次，每次2 h，10倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，65 ℃减压浓缩至无醇味。提取物经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(20:1、10:1、5:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(10:1、5:1、1:1)、甲醇洗脱，薄层色谱检测，合并相同流份后，得到H-1~H-9共9个组分。
H-1~H-3组分合并后经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 10:1、5:1、2:1）分离，葡聚糖凝胶柱色谱纯化得到化合物1（11 mg）。H-4~H-6组分合并，经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯 10:1、5:1、1:1）分离，合并较纯斑点，再经反相C18柱，葡聚糖凝胶柱色谱（40%甲醇）纯化2次，硅胶柱色谱分离得到化合物2 （19 mg）和 化合物3（39 mg）。H-7和H-8组分合并后甲醇溶解，溶解部分经反相C18柱分离，收集7-1至7-7共7个组分。7-1经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 1:1）分离，反相体系分离，葡聚糖凝胶柱色谱（40%甲醇）纯化2次，再经硅胶柱色谱纯化，培养结晶析出白色固体，得到化合物8（9 mg）。7-2经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇1:1）分离，葡聚糖凝胶柱色谱(45%甲醇)纯化2次，得到化合物4（15 mg）和化合物5（7 mg）。7-4经硅胶柱色谱(乙酸乙酯-甲醇 1:1)分离，再经反相C18柱色谱(10%甲醇)，葡聚糖凝胶柱色谱，硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇 2:1)纯化，得到化合物7（6 mg）。H-9组分经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 1:1），反相C18柱色谱（10%甲醇），葡聚糖凝胶柱色谱分离后，合并较纯斑点，析出固体过滤，得到化合物6（9 mg）。三斑海马提取分离过程见图2。
图 2 三斑海马提取分离流程图
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化合物1为白色粉末，分子式为C9H11NO2。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 7.38 (2H, dd, J=7.4, 6.8 Hz, H-3', 5'), 7.33 (1H, t, J=6.9 Hz, H-4'), 7.27 (2H, dd, J=7.4, 6.8 Hz, H-2', 6'), 3.93 (1H, dd, J=7.9, 5.2 Hz, H-2), 3.24 (1H, m, H-3a), 3.06 (1H, m, H-3b); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 36.4 (C-3), 56.1 (C-2), 127.7 (C-4′), 129.1 (C-3′, 5′), 129.4 (C-2′, 6′), 135.1 (C-1′), 173.9 (C-1)。该化合物核磁共振数据与参考文献[8]基本一致，确定化合物为L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)。
化合物2为白色固体，分子式为C3H7NO2。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.70 (1H, q, J=6.4 Hz, H-2), 1.40 (3H, d, J=6.4 Hz, H-3); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 16.1 (C-3), 50.6 (C-2), 175.8 (C-1)。该化合物核磁共振数据与参考文献[9]基本一致，确定化合物为丙氨酸(alanine)。
化合物3为白色固体，分子式为C10H12N4O5。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.76 (1H, m, H-5'), 3.54 (1H, m, H-5'), 4.21 (1H, m, H-3'), 4.36 (1H, m, H-2'), 6.00 (1H, d, J=5.7 Hz, H-1'), 8.12 (1H, s, H-2), 8.24 (1H, s, H-8); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 61.3 (C-5′), 70.4 (C-3′), 74.1 (C-2′), 85.5 (C-4′), 88.4 (C-1′), 124.2 (C-5), 140.2 (C-2), 146.1 (C-8), 148.4 (C-4), 158.4 (C-6)。该化合物核磁共振数据与参考文献[10]基本一致，确定化合物为肌苷(inosine)。
化合物4为针状结晶，分子式为C27H46O。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ : 5.37 (1H, m, H-6), 3.55 (1H, m, H-3), 0.68 (3H, s, H-18); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ : 11.9 (C-18), 18.7 (C-21), 19.4 (C-19), 21.1 (C-11), 22.5 (C-26), 22.8 (C-27), 23.8 (C-15), 24.3 (C-23), 28.0 (C-25), 28.2 (C-12), 29.7 (C-2), 31.7 (C-8), 31.9 (C-7), 35.8 (C-20), 36.2 (C-22), 36.5 (C-10), 37.3 (C-1), 39.5 (C-24), 39.8 (C-16), 42.3 (C-13), 42.3 (C-4), 50.2 (C-9), 56.2 (C-17), 56.8 (C-14), 71.8 (C-3), 121.7 (C-6), 140.8 (C-5)。该化合物核磁共振数据与参考文献[11]基本一致，确定化合物为胆固醇(cholesterol)。
化合物5为褐色固体，分子式为C10H13NO2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 6.96 (2H, d, J=1.8 Hz, H-2, 6), 6.68 (2H, d, J=1.8 Hz, H-3, 5), 2.73 (2H, m, H-8), 2.55 (2H, m, H-7), 1.74 (3H, s, CH3); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 24.6 (CH3), 38.2 (C-7), 43.6 (C-8), 115.6 (C-3, 5), 129.8 (C-2, 6), 156.4 (C-4), 176.7 (C-10)。该化合物核磁共振数据与参考文献[12]基本一致，确定化合物为N-乙酰基酪胺(N-acetyltyramine)。
化合物6为类白色固体，分子式为C4H4N2O2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 5.45 (1H, d, J=7.5 Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J=7.5 Hz, H-6), 10.81 (1H, br s, NH), 11.00 (1H, br s, NH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 100.7 (C-5), 142.6 (C-6), 151.9 (C-2), 164.8 (C-4)。该化合物核磁共振数据与参考文献[13]基本一致，确定化合物为尿嘧啶(uracil)。
化合物7为白色固体，分子式为C6H14O6。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.80 (2H, m), 3.73 (2H, m), 3.70 (2H, m), 3.61 (2H, m); 13C NMR (150 MHz,D2O) δ : 63.2 (C-1, 6), 69.3 (C-3, 4), 70.9 (C-2, 5)。该化合物核磁共振数据与参考文献[14]基本一致，确定化合物为D-甘露醇(D-mannitol)。
化合物8为白色固体，分子式为C4H8SO2Cl2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 3.36 (2H, t, J=6.6 Hz), 3.19 (2H, t, J=6.6 Hz); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 35.4, 47.5。该化合物核磁共振数据与参考文献[15]基本一致，确定化合物为河豚素 (tetrodoine)。
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近年来，海洋生物因其次生代谢产物具有独特的结构骨架和特殊的药理活性受到了广泛关注，海马作为常见的海洋动物，同时也是经济价值较高的名贵中药，药用历史悠久、疗效显著，备受关注。研究发现，海马中含有多种化学成分，包括胆固醇、胆甾-4-烯-3-酮、胆甾-5-烯-3β, 7α-二醇等甾体化合物；苯丙氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、牛磺酸等多种氨基酸；SHP-1、HTP-1、HKPLP等多肽类成分；十四酸、EPA、DHA等脂肪酸类成分，以及核酸类、糖蛋白、肌酸酐等。药理研究表明，海马提取物可改善肾阳虚模型动物的体征，提高性激素水平；可通过调节NF-κB和MAPK信号通路抑制炎症因子的释放从而发挥抗炎作用；可通过清除自由基发挥抗氧化作用；还可增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高免疫力等；此外，海马提取物对骨质疏松的防治具有一定的作用，为动物药抗骨质疏松研究提供了新方向[2,7,16-19]。
本研究从三斑海马中分离得到了8个化合物，其中N-乙酰基酪胺、D-甘露醇、河豚素为首次从三斑海马中分离得到，进一步明确了三斑海马的化学成分。赵晓喆等[20]采用核磁代谢组学技术在三斑海马甲醇提取物中指认出33种化学成分，其中包括丙氨酸、苯丙氨酸和肌苷。陈璐[4]通过HPLC-MS分析得到海马化学成分中含有核酸类成分3种，即尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤；此外，从海马中分离鉴定出的甾体类化合物以胆固醇为主，占总胆甾醇的59.02%~95.99%。José等[21]从溶藻弧菌的菌株M3-10中分离到了N-乙酰基酪胺，发现其具有较高的细菌群体感应抑制剂的活性，并且N-乙酰基酪胺可逆转阿霉素耐药白血病P388细胞的耐药性[22]，提示在中药海马中N-乙酰基酪胺可能通过独特的途径参与发挥抗菌抗炎作用。甘露醇是临床常用的脱水剂，在治疗脑水肿、降低颅内压等方面发挥重要作用，具有清除自由基、抗氧化等活性[23]，可能参与中药海马的抗氧化过程。基于海马显著的药效活性，深入探究海马的药效物质基础，对中药海马进一步的开发和应用具有非常重要的意义。
Study on chemical constituents of Hippocampus trimaculatus Leach
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摘要:
目的 研究三斑海马的化学成分。 方法 采用乙醇提取和硅胶柱色谱、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱、反相C18柱色谱等方法对三斑海马化学成分进行分离纯化，通过理化性质、波谱数据和文献对比，对得到的化合物进行结构鉴定。 结果 从三斑海马中分离得到8个化合物，分别鉴定为：L-苯丙氨酸(1)、丙氨酸(2)、肌苷(3)、胆固醇(4)、N-乙酰基酪胺(5)、尿嘧啶(6)、D-甘露醇(7)、河豚素(8)。 结论 化合物5、7、8为首次从三斑海马中分离得到。 Abstract:Objective To study the chemical constituents of Hippocampus trimaculatus Leach. Methods After extracted with ethanol, Hippocampus trimaculatus Leach was isolated and purified by silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography, and reversed-phase C18 column chromatography. The structures of compounds were identified by physical and chemical properties, spectral data and literature comparison. Results Eight compounds were isolated from Hippocampus trimaculatus Leach and identified as L-phenylalanine (1), alanine (2), inosine (3), cholesterol (4), N-acetyltyramine (5), uracil (6), D-mannitol (7), tetrodoine (8), respectively. Conclusion Compounds 5, 7, 8 are isolated from Hippocampus trimaculatus Leach for the first time. -
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