挑取少量冻存于−80℃、30% 甘油中的菌株，在YPD 液体培养基中活化，30℃，200 r/min振荡培养24 h后，吸取10 μl置于新的1 ml YPD液体培养基中，继续在 30℃，200 r/min振荡条件下培养 16 h，用 SDA 固体培养基划板，30℃培养 48 h，置于 4℃ 保存备用。实验时挑取 SDA 平板上的单克隆菌落置于1 ml YPD 液体培养基中，30℃，200 r/min振荡培养 16 h 过夜，使其处于对数生长期用于后续实验。

白念珠菌活化16 h ，用YPD液体培养基调整菌浓度至3×10⁶细胞/ml。制备每种菌株的系列稀释液，以10倍倍比稀释成5个浓度梯度，每种白念珠菌的系列浓度稀释物各取5 μl，点在事先加入了待考察的不同浓度的化学试剂和药物的YPD琼脂平板上，倒置于孵箱内，25、30、37 ℃培养24～48 h，期间观察各菌株之间生长的差异并拍照记录。

收集处于对数生长期的白念珠菌细胞悬浮液，用无菌PBS洗涤3次。随后将细胞重悬于无菌PBS中调整其浓度至5×10⁷细胞/ml，孵育2 h以耗尽能量，并加入终浓度为10 μmol/L的罗丹明6G。30℃、200 r/min振荡培养细胞悬浮液60 min，使罗丹明6G积累。洗涤白念珠菌细胞悬浮液3次，注意要保证白念珠菌细胞最终浓度为5×10⁷细胞/ml。然后加入终浓度为20 mmol/L的葡萄糖。分别在25 、30、37℃ 条件下，200 r/min振荡培养白念珠菌细胞悬浮液2 h，取白念珠菌细胞样品(约1 ml)离心，收集上清液，在527 nm处测量吸光度。

使用GraphPad Prism软件对全部数据进行分析，时序检验 (Mantel Cox) 方法比较各组差异 ，当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。

我们利用多种刺激剂考察了SDH2在白念珠菌应激反应中的作用。实验应用了sdh2Δ/Δ敲除菌、野生型菌和回复菌，考察在存在应激刺激剂的培养基中sdh2Δ/Δ敲除菌的生长情况与野生型菌和回复菌的区别，从而判断SDH2在白念珠菌应激反应中的作用。应激刺激剂包括细胞壁应激刺激剂（十二烷基硫酸钠和咖啡因）、渗透压应激刺激剂（氯化钠）、氧化应激刺激剂（过氧化氢、二酰胺和甲萘醌）。敏感性实验在25、30、37 ℃三种不同的温度下进行，将不同浓度相同体积的白念珠菌接种于琼脂培养板上，同样的培养板制备3份，白念珠菌生长形成明显的菌落后拍照。结果显示，与野生型菌或回复菌相比，sdh2Δ/Δ敲除菌于25 ℃在0.03%十二烷基硫酸钠培养板上生长得多（图1A）。此外，在所有培养温度下，sdh2Δ/Δ敲除菌在含咖啡因、二酰胺或甲萘醌的培养板上也较野生型菌/回复菌生长得多 (图1A、1B、1C)。

图  1  SDH2基因缺失菌与野生型菌株对各种应激刺激剂的敏感性

我们考察了sdh2Δ/Δ敲除菌、野生型菌和回复菌对抗真菌药物的敏感性，考察的药物包括唑类抗真菌药物特比萘芬、两性霉素B、氟胞嘧啶和阿尼芬净。将不同浓度相同体积的白念珠菌接种于琼脂培养板上，同样的培养板制备3份，白念珠菌生长形成明显的菌落后拍照。药物敏感性实验结果显示，与野生型菌/回复菌相比，sdh2Δ/Δ敲除菌在含有氟康唑、酮康唑和伊曲康唑的培养板上生长得明显减少(图2A、2B、2C)，而在含有其他抗真菌药物，如特比萘芬、两性霉素B、氟胞嘧啶和阿尼芬净的培养板上没有明显差别。

图  2  SDH2基因缺失菌与野生型菌株对抗真菌药物的敏感性

罗丹明6G是ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白的特异性底物，在能量不足时以被动扩散的方式进入白念珠菌细胞，加入葡萄糖供能后，可通过药物外排泵以主动转运的方式泵出细胞外。我们通过罗丹明6G的外排实验考察了SDH2敲除对白念珠菌药物外排能力的影响。结果显示在30 ℃和37 ℃ 培养温度下，通过添加葡萄糖以启动能量代谢2 h后，与野生型菌相比，从sdh2Δ/Δ敲除菌的细胞中泵出的罗丹明6G显著减少(P<0.01，见图3)。有趣的是，在25 ℃ 的培养温度下，3种菌株泵出的罗丹明6G都较30 ℃和37 ℃条件下有所减少，但各菌株之间没有显著差异(图3)。

图  3  SDH2基因缺失菌与野生型菌株对罗丹明6G的外排能力

SDH2编码琥珀酸脱氢酶中的一个亚基，琥珀酸脱氢酶参与三羧酸循环，并且它位于线粒体内膜上，发挥电子传递的作用，对于能量代谢十分重要^[8]。我们对SDH2基因在白念珠菌环境适应性中的作用进行了初步探索，实验选择在30 ℃（白念珠菌最适宜生长温度）、37 ℃（宿主温度）和25 ℃（室温）三种温度下进行。实验之所以选用三种温度，一方面是由于在不同环境温度下白念珠菌的代谢可能不同，选用不同的温度可以考察温度造成的差别；另一方面在三种温度下考察SDH2基因的功能，结果相互之间可以比较或者印证，增加信息量，有利于分析SDH2基因的功能。有意思的是SDH2基因缺失后菌株对唑类抗真菌药物（氟康唑、酮康唑、伊曲康唑）的敏感性显著上升，而对于其他类型的抗真菌药物包括丙烯胺类特比萘芬、多烯类两性霉素B、核苷类氟胞嘧啶和棘白菌素类阿尼芬净，其敏感性和野生型菌没有差异。唑类药物的敏感性与药物外排泵的功能密切相关，药物外排功能障碍可导致对唑类抗真菌药物敏感性增加^[9]。药物外排泵包括ABC转运蛋白超家族和主要易化因子超家族，其中ABC转运蛋白中的Cdr1p、Cdr2p发挥作用都需要消耗能量。罗丹明6G是能量依赖型ABC转运蛋白的特异性底物，通过外排泵以能量依赖的主动转运方式排出细胞外。罗丹明6G外排实验的结果能显示能量依赖型ABC转运蛋白的功能。研究发现SDH2缺失后白念珠菌在30 ℃和37 ℃时外排能力都显著降低。SDH2对能量代谢非常重要，SDH2基因缺失后，菌株能量代谢异常，能量依赖型ABC转运蛋白的功能下降，缺失菌对唑类抗真菌药物的敏感性增加。

SDH2基因缺失后白念珠菌对咖啡因、二酰胺和甲萘醌都表现出轻微的耐受，这提示SDH2基因在白念珠菌环境应激中有一定的作用，这些环境因素包括细胞壁压力的刺激以及氧化刺激，具体的作用机制还有待进一步探讨。

综上所述，本研究发现SDH2基因缺失会导致白念珠菌对环境压力应激反应的改变；此外，SDH2基因缺失后菌株的药物外排能力降低，菌株对唑类抗真菌药物的敏感性增加。代谢对白念珠菌的环境适应能力和致病力十分重要，SDH2基因缺失导致白念珠菌对唑类抗真菌药物专特性地敏感，以SDH2为靶基因，开发真菌特异性SDH2抑制剂，有望发现与唑类药物协同的新型抗真菌药物。