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血红铆钉菇[Chroogomphus rutilus (Schaeff.) O.Ƙ. Mill.]，属担子菌亚门伞菌目铆钉菇科铆钉菇属[1]。菌体铆钉状且菌肉为酒红色，故名血红铆钉菇。分布于中国北方及西南多省，以及日本、欧洲及北美多国，主要生于松林中地上的杂草丛林之间，是一种与油松、樟子松、马尾松、赤松共生的外生菌根真菌，群生、散生或单生，营养价值极高，深受人们喜爱[2]。研究表明，血红铆钉菇富含蛋白质、多糖、黄酮、香豆素及甾醇[3-8]等多种活性物质，具有极高的食用和药用价值。随着人民生活水平的提高和科学技术的不断进步，糖化学及其活性研究正在经历着飞速的发展，越来越多的动物多糖、植物多糖、真菌多糖被开发利用。多糖作为食用菌重要的活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、免疫调节、神经保护、降血糖、降血脂[9-13]等诸多药理作用。目前，各类真菌多糖的免疫调节作用研究已广泛开展[14-23]。然而，迄今关于血红铆钉菇多糖开发的研究较少，对其免疫调节作用的研究报道亦少，本文探讨血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性、免疫调节因子释放、NF-κB信号通路激活等一系列的免疫调节作用，以期为血红铆钉菇进一步的开发利用提供依据。
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RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库，储藏于牡丹江医学院医药研究中心−80 ℃冰箱中，经复苏后，置于含10% FBS的DMEM培养基中培养。
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血红铆钉菇经25%乙醇沉淀后，通过DEAE-52纤维柱洗脱出多糖组分CRPS25-Ⅱ，实验室自制。
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κZ-II匀浆仪（Servicebio）；κZ-II酶标仪（Rayto）；D3024R台式高速冷冻型微量离心机、D1008E台式高速冷冻离心机（DRAGONLAB）；Stepone plus荧光定量PCR仪（ABI）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏净安泰）；NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo）；G0203-150G化学发光仪（CLINX）；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）。
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RNA提取液(批号：G3013)、引物、RIPA裂解液(批号：G2002)、PMSF(100mM，批号：G2008)、磷酸化蛋白酶抑制剂(批号：G2007)、β-肌动蛋白(批号：GB12001)、GAPDH(批号：GB12002)、Histone H3(批号：GB11026)、HRP标记山羊抗兔(批号：GB23303)、HRP标记驴抗山羊(批号：GB23404)、HRP标记山羊抗小鼠(批号：GB23301)、HRP标记山羊抗大鼠(批号：GB23302)、转移缓冲液(批号：G2017)、电泳缓冲液(批号：G2018)、TBS缓冲液(批号：G0001-2L)均购自Servicebio公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，RAW264.7细胞以1×106个细胞/孔接种于96孔板中，随后，置于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h（边缘孔用无菌PBS填充），培养完成后去除原有培养基，加入浓度梯度分别为25、50、100、200、400 μg/ml的血红铆钉菇多糖溶液（各设置6个复孔）于恒温箱中培养12 h。弃去孔内原有培养液，每孔加入配制好的MTT溶液20 μl，连续培养4 h后，弃去原有MTT溶液。每孔加入150 μl DMSO，于恒温箱中孵育10 min后，用锡纸包裹避光，操作轻盈防震，使结晶物充分溶解。孵育完成后，置于490 nm处测定吸光度（A）值。计算细胞增殖活力：细胞增殖活力=[(试验组OD均值－对照组OD均值)/ 对照组OD均值]×100%。实验表明血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在25～400 μg/ml的范围内无明显的细胞毒性，见图1。
图 1 血红铆钉菇多糖对巨噬细胞毒性的影响
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，随后以每孔1×106个细胞接种于六孔培养板中，加入1 ml的DMEM完全培养基，并于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h。设置不同浓度梯度的血色铆钉菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白对照组，于恒温培养箱中孵育12 h。弃去原培养基，PBS清洗2次，加入1 ml的Trizol试剂（冰上操作）。12000 r/min离心10 min取上清。加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min。4 ℃下12000 r/min离心10 min。将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。−20 ℃放置15 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。吸除液体，加入75%乙醇1.5 ml洗涤沉淀。4 ℃下12 000 r/min离心5 min。将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min。加入15 μl无RNA酶的水溶解RNA。55 ℃孵育5 min。使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μl待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，开始吸光值检测。将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100～500 ng/μl。
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取一PCR管，加入含10 μl RNA的溶液。加入0.5 μl Oligo (dT)18底物和0.5 μl随机六聚体引物。用无核糖核酸酶的去离子水补足至15 μl。于PCR仪上65 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却。依次加入4 μl×5反应缓冲液，1 μl RT酶混合物，用移液器抽吸混匀。于PCR仪上42 ℃保温60 min，结束后70 ℃保温5 min灭活反转录酶。
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①取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2×荧光定量PCR试剂10 μl；2.5 μmol/L基因引物2 μl；反转录产物2 μl；双蒸水6 μl。
②PCR扩增：预变性95 ℃，10 min；循环（40次）95 ℃，15 s→60 ℃，60 s；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃
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使用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果表明，血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范围内对细胞炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达均有促进作用，其中在40 μg/ml时达到峰值，80～160 μg/ml呈逐渐减弱的趋势，见图2。
图 2 血红铆钉菇多糖对RAW264.7细胞炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达的影响
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，随后以每孔1×106个细胞接种于六孔培养板中，加入1 ml的DMEM完全培养基，并于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h。设置不同浓度梯度的血色铆钉菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白对照组，于恒温培养箱中孵育12 h，用PBS冲洗细胞2～3次，最后一次清洗完成，倒掉PBS，用移液器尽量吸干残留液体；加入适当体积的RIPA裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/培养瓶内3～5 min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触；用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5 ml离心管中；冰上裂解30 min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12000 r/min，4 ℃，离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液.
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将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，置于−20 ℃冰箱保存备用。
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清洗玻璃板；制胶与上样，放入制胶器，插入斜插板将玻璃板固定，检查底部是否对齐，避免漏胶；将分离胶灌到适当的高度，将纯水缓慢均匀加入到分离胶上层，直至加满。大约30 min后待分离胶凝固即可倒去分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；配制5%的浓缩胶，加入四甲基乙二胺后立即混合均匀，灌胶，开始电泳；电泳至溴酚蓝里最底部大约1 cm即可终止电泳，进行转膜。将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中，快速涮洗一次，然后加上脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30 min；按照抗体说明书，进行一抗稀释，配制好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配制好的一抗，4 ℃孵育摇床过夜；回收一抗，用TBST快速涮洗膜3次，然后加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5 min，洗3次；将二抗用TBST按照1∶5000的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育30 min；用TBST快速涮洗膜3次，然后再加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5 min，洗3次。
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在暗室中将ECL A液和ECL B液两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜，将聚偏二氟乙烯膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1～2 min后，去尽残液，盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。
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胶片扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，使用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。结果表明，血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范围内对细胞p-P65蛋白的表达有促进作用，其中在40 μg/ml时达到峰值，80～160 μg/ml呈逐渐减弱的趋势，见图3。
图 3 血红铆钉菇多糖对RAW264.7细胞p-P65蛋白表达量的影响
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本文对血红铆钉菇多糖进行了研究，在实验室通过水提醇沉的方法制备出血红铆钉菇多糖，通过DEAE纤维素-52柱层析精制得到CRPS25-Ⅱ，而后将CRPS25-Ⅱ溶液按1～800 μg/ml浓度分别加入细胞悬液中，按照6、12、24 h进行培养，考察多糖浓度和孵育时间对巨噬细胞RAW264.7的影响，最终发现1～400 μg/ml浓度范围孵育12 h细胞生长状态良好，适于实验研究。
人体的免疫系统调控着机体健康的平衡与稳定，巨噬细胞是人体天然免疫防线的重要一员，参与机体的非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）。巨噬细胞可以呈递抗原、分泌细胞因子等生物活性物质，从而调控机体微环境，达到抗炎、抗肿瘤的作用，细胞因子通过调节细胞分化、生长和凋亡控制整个机体的动态平衡。
本实验是以小鼠腹腔巨噬细胞为靶细胞，研究CRPS25-Ⅱ体外的免疫调节活性，探讨CRPS25-Ⅱ在体内发挥免疫调节活性的作用机制。通过MTT法检测了CRPS25-Ⅱ对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性，数据表明多糖浓度在25～400 μg/ml范围内CRPS25-Ⅱ不具有细胞毒性，说明该药物应用于临床的安全性较高，具备深入研究的意义。通过RT-PCR法证实CRPS25-Ⅱ可显著促进腹腔巨噬细胞释放IL-6和TNF-α等细胞因子，通过增强细胞因子的活性，达到抗炎、抗肿瘤的目的。研究表明多糖浓度在1～160 μg/ml的范围内，CRPS25-Ⅱ对IL-6和TNF-α释放具有显著促进作用，其中1～40 μg/ml浓度范围呈上升趋势，40～160 μg/ml范围内随着CRPS25-Ⅱ的浓度的增加对IL-6和TNF-α释放的促进作用逐渐减弱。Western blot试验显示，CRPS25-Ⅱ作用于RAW264.7细胞12 h后，1～160 μg/ml浓度范围内血红铆钉菇多糖均可显著诱导RAW264.7细胞中p-P65蛋白的表达，从而激活NF-κB信号通路，达到免疫调节的作用。其中1～40 μg/ml浓度范围对p-P65蛋白分泌的促进作用呈上升趋势，40～160 μg/ml范围内随着CRPS25-Ⅱ的浓度的增加p-P65蛋白的促进作用逐渐减弱。
综上所述，血红铆钉菇多糖具有显著的免疫调节活性，作为一种新型的免疫调节剂，具有较为广阔的开发前景，后续工作可进行更加系统深入的研究。
Immunoregulatory effect of polysaccharides derived from chroogomphus rutilus on macrophage cell line RAW264.7
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摘要:
目的 研究血红铆钉菇多糖对RAW264.7小鼠单核巨噬细胞的免疫调节作用。 方法 将小鼠的巨噬细胞进行复苏培养，制备细胞悬液，设置空白对照组以及不同质量浓度的血红铆钉菇多糖（CRPS25-Ⅱ）组（1、20、40、80和160 μg/ml）。采用MTT法测定血红铆钉多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性；采用RT-PCR法检测血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌免疫调节因子IL-6和TNF-α的影响；采用Western-blot法检测血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的NF-κB信号通路中p-P65蛋白表达的影响。 结果 实验证明血红铆钉菇多糖在1～160 μg/ml的范围内没有明显的细胞毒性，CRPS25-Ⅱ质量浓度在1～160 μg/ml可提高细胞因子的分泌量，从而促进细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表达；CRPS25-Ⅱ可促进p-P65蛋白的磷酸化，激活NF-κB信号通路从而促进细胞的免疫调节作用，1～160 μg/ml浓度范围内均可促进p-P65蛋白的增加，1～40 μg/ml呈上升趋势，40～160 μg/ml促进作用逐渐减弱。 结论 血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞无毒性，且可以促进炎症因子IL-6和TNF-α的分泌以及激活NF-κB信号通路，从而起到免疫调节作用。 Abstract:Objective To study the immunomodulatory effect of polysaccharides (CRPS25-Ⅱ) derived from Chroogomphus rutilus on mouse mononuclear macrophages, RAW264.7 cells. Methods RAW264.7 cells were resuspended and cultured, cell suspension was prepared. The blank control group and CRPS25-Ⅱ groups with different mass concentrations (1, 20, 40, 80 and 160 μg/ml) were set up. MTT assay was used to determine the cytotoxicity of CRPS25-Ⅱ on RAW264.7 cells. RT-PCR was used to detect the effects of CRPS25-Ⅱ on the secretion of immune regulatory factors IL-6 and TNF-α from RAW264.7 cells. Western blot was used to detect the effects of CRPS25-Ⅱ on the expression of p-P65 protein in NF-κB pathway of RAW264.7 cells. Results The results showed that CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) had no obvious cytotoxicity. CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) increased the secretion of cytokines, and thus promoted the mRNA expression of IL-6 and TNF-α. CRPS25-Ⅱ increased the phosphorylation of p-P65 protein and activated the NF-κB signaling pathway, and thus promoted the immune regulation of cells. CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) could increase the p-P65 protein, and the promoting effects of CRPS25-Ⅱshowed an upward trend in the concentration range of 1−40 μg/ml and gradually weakened in the concentration range of 40−160 μg/ml. Conclusion Polysaccharides derived from chroogomphus rutilus had no cytotoxicity to mouse macrophages, and could promote the secretion of inflammatory factors IL-6 and TNF-α and activate the NF-κB signaling pathway, thus playing an immunomodulatory role. -
Key words:
- CRPS25-Ⅱ /
- RAW264.7 cells /
- immune regulation
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